Histopatologia, czasami nazywana również patologią komórkową, koncentruje się na badaniu patologicznych zmian anatomicznych zachodzących w chorej tkance na poziomie mikroskopowym.

Rozpoznanie histopatologiczne umożliwia: diagnozowanie chorób nowotworowych, określenie stadium rozwoju nowotworu, wykrywanie schorzeń zapalnych, zakaźnych, czy pasożytniczych, schorzeń zwyrodnieniowych, a także monitorowanie postępu leczenia. A w niektórych przypadkach niestety określenie przyczyny zgonu.

Przedmiot badania histopatologicznego

Podstawowym przedmiotem badania histopatologicznego jest diagnostyczna klasyfikacja patologicznie zmienionej tkanki (histologia) oraz ocena morfologii komórki (cytologia), czyli ocena histologiczna i cytologiczna tkanki.

Ocena tkanek i komórek za pomocą mikroskopii świetlnej wymaga bardzo wszechstronnych umiejętności w zakresie opracowania i konserwowania oraz końcowej oceny pobranych wycinków. Alternatywą dla tradycyjnych badań makroskopowych i mikroskopowych są nowe procedury koncentrujące się na poziomie komórkowym.

Badanie histopatologiczne

Badanie histopatologiczne obejmuje zazwyczaj biopsję, czyli procedurę polegającą na pobraniu niewielkiej próbki tkanki. Wycinek pobrany w trakcie biopsji lub zabiegu chirurgicznego jest wysyłany do laboratorium, gdzie jest opracowywany i utrwalany w procesach zatapiania, cięcia oraz barwienia.

Pobieranie materiału do badań

Próbki tkanek pobierane są przy użyciu następujących technik:

  • Biopsja trepanem stosowana w przypadku wyczuwalnych dotykiem guzków piersi, podejrzeń wynikających z badania dotykowego prostaty, zmian w wątrobie, nerkach lub na skórze
  • Śródoperacyjne pobranie próbki tkanek w wyniku biopsji lub wycięcia tkanki podczas histerektomii lub prostatektomii
  • Usunięcie lub nakłucie endoskopowe w wyniku biopsji lub wycięcia podejrzanego obszaru tkanki podczas diagnostycznej procedury endoskopowej, np. kolonoskopii lub gastroskopii

Cytopatologia

Przedmiotem badania cytopatologicznego jest ocena komórki i mniejszych skupisk komórek (w szczególności zmian cytoplazmatycznych i jądrowych). Próbki pobierane są przy użyciu następujących technik:

  • Cytologia złuszczająca: ocena złuszczonych komórek (np. w płynach ustrojowych) lub komórek pobranych mechanicznie (np. szpatułką)
  • Biopsja aspiracyjna cienkoigłowa, w której cienka, wydrążona igła używana jest do pobrania próbki komórek do analizy z bryły lub masy, np. w przypadku podejrzenia raka tarczycy lub piersi.

Badanie cytologiczne analizuje komórki, a procedury ich pobierania są stosunkowo proste i minimalnie inwazyjne. W histologii tkankę uzyskuje się technikami inwazyjnymi. Pozwala to jednak na ocenę miejscowego rozsiewu guza (stadium choroby).

Przygotowanie preparatów mikroskopowych

Histopatologia obejmuje przygotowanie materiału tkankowego na szkiełkach mikroskopowych do badań, co jest prawdopodobnie najbardziej istotnym elementem procesu, ponieważ to właśnie szkiełka z utrwalonym preparatem są ostatecznie badane pod mikroskopem.

Przygotowanie jest zwykle procesem pięcioetapowym. Etapy te to:

  • Utrwalanie i Odwanianie
  • Zatapianie i Formowanie bloczków
  • Krojenie skrawków
  • Barwienie
  • Zamykanie preparatu szkiełkiem nakrywkowym

Utrwalanie i Odwadnianie

Utrwalanie materiału ma na celu natychmiastowe zatrzymanie procesów metabolicznych w komórkach i tkankach, przede wszystkim przez zahamowanie aktywności enzymów. Utrwalanie możemy podzielić na chemiczne i fizyczne. Utrwalanie chemiczne polega na przepojeniu tkanki roztworem utrwalającym, najczęściej stosowanym jest roztwór formaldehydu (aldehyd mrówkowy 2-10%). Utrwalanie fizyczne polega na oddziaływaniu na materiał mikrofalami lub promieniowaniem jonizującym.

Kolejnym etapem po utrwaleniu materiału jest odwodnienie czyli usunięcie wody z pobranej tkanki. W procesie odwadniania zastępujemy wodę obecną w tkance szybko penetrującym alkoholem o wzrastających stężeniach.

Formowanie to zatopienie wypreparowanego, utrwalonego wycinka w substancji umożliwiającej utworzenie bloczku, z reguły w płynnej parafinie, np. w stacjach zatapiania. Obecnie do opracowywania materiału w technice parafinowej używa się kasetek histopatologicznych.

Szczególnie ważnym etapem proces przygotowania szkiełek jest cięcie preparatu na skrawki, ponieważ muszą one być wystarczająco cienkie, aby umożliwić wyraźną i dokładną obserwację najdrobniejszych szczegółów komórki technikami mikroskopii elektronowej lub mikroskopii świetlnej pozwalającymi szczegółowo przeanalizować mikrostrukturę tkanki.

Cięcie na skrawki zazwyczaj wymaga użycia urządzeń zwanych mikrotomami. Mikrotom składa się z czterech podstawowych części; noża mikrotomowego lub uchwytu mocującego żyletki mikrotomowe, stolika przedmiotowego, na którym montuje się skrawany bloczek, mechanizmu skrawania oraz mechzanizmu regulującego grubość skrawków. Mikrotomy, takie jak mikrotomy rotacyjne, mikrotomy saneczkowe i wibrotomy, pozwalają ciąć preparaty parafinowe w temperaturze pokojowej. Jednak przygotowanie skrawków może wymagać ich zamrożenia, do czego wykorzystuje się kriostaty. Kriostaty pozwalają ciąć preparaty na skrawki o grubości od kilku do kilkudziesięciu mikronów (μm), a grubość cięcia uzależniona jest od techniki wykonywania analizy oraz innych czynników, takich jak rodzaj tkanki.

Tak przygotowane skrawki poddawane są barwieniu.

Barwienie szkiełek

Barwienie szkiełek odbywa się z reguły manualnie lub w zautomatyzowanych stacjach barwienia lub procesorach tkankowych w oparciu o różne protokoły barwienia przy pomocy specjalnych barwników. Barwienie histochemiczne (zazwyczaj przy pomocy hematoksyliny i eozyny – barwienie „HE”), pozwala zapewnić odpowiedni kontrast skrawków tkanek, dzięki czemu struktury tkanek są lepiej widoczne i łatwiejsze do oceny. W niektórych przypadkach do dalszej analizy wymagane są barwienia immunohistochemiczne, takie jak HER2 lub Ki-67.

Właściwe barwienie preparatu ułatwia różnicowanie i identyfikację szkiełek, które następnie mogą zostać poddane ocenie mikroskopowej lub zostać zeskanowane i poddane komputerowej diagnostyce histologicznej.

Zamykanie preparatu szkiełkiem nakrywkowym

Zamykanie preparatu szkiełkiem nakrywkowym w bezwodnym medium (niepolarne żywice). Proces ten polega na n naniesieniu na powierzchnię skrawka kropli medium do nakrywania (obecnie są to żywice niepolarne) i delikatnym umieszczeniu na nim szkiełka nakrywkowego. Proces zamykania preparatów szkiełkiem nakrywkowym, odbywa się manualnie lub coraz częściej przy pomocy automatycznych nakrywarek.

Rozpoznanie histopatologiczne

Rozpoznanie polega na szczegółowym badaniu mikroskopowym chorych tkanek we wcześniej przygotowanym preparacie w oparciu o różnicowanie struktur tkanek i narządów oraz wyraźnie widoczne szczegóły komórek. Przy czym cechy wykorzystywane do wykrywania i diagnozowania choroby nowotworowej na podstawie obrazów mikroskopowych obejmują kształt i rozmiar komórek, kształt oraz rozmiar jąder komórkowych, a także rozmieszczenie komórek w tkance.

Przy mikroskopowej ocenie tkanek i komórek stosowane są:

  • Mikroskopy jasnego pola, które wykorzystują zwykłe światło, a kolory preparatów są wynikiem barwienia tkanek
  • Mikroskopy fluorescencyjne wykorzystujące światło UV, pod wpływem którego widoczne są cząsteczki sond fluorescencyjnych
  • Mikroskopy kontrastowo-fazowe wykorzystujące różnice we współczynnikach załamania światła różnych składników komórek i tkanek, co pozwala uzyskać obraz bez barwienia i umożliwia obserwację żywych komórek
  • Mikroskopy konfokalne skanujące próbki światłem lasera w kolejnych płaszczyznach ogniskowych i umożliwiające trójwymiarową rekonstrukcję próbki na podstawie dużej liczby uzyskanych obrazów.

Rozwój technologii umożliwił digitalizację obrazów tkanek i komórek w skali mikroskopowej w bardzo wysokiej rozdzielczości i zapoczątkował nowe, ulepszone metody badań tkankowych za pomocą mikroskopii cyfrowej i cyfrowej analizy obrazu.

Mikroskopia cyfrowa i wirtualne repozytoria preparatów

Skanery do obrazowania szkiełek umożliwiają digitalizację preparatów histologicznych, a uzyskane obrazy cyfrowe można przechowywać w wirtualnych repozytoriach preparatów i przeglądać je za pomocą komputerów zamiast mikroskopów.

Łatwiejsze i szybsze udostępnianie obrazów histologicznych ułatwia konsultacje oraz przechowywanie obrazów histologicznych w codziennej praktyce klinicznej, a także umożliwia zachowanie jakości barwionych preparatów oraz opisywanie ich interesujących cech. W połączeniu z rozwojem oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu utorowało to drogę do opracowania narzędzi, które umożliwiają także ocenę ilościową badanych preparatów.

Nie można lekceważyć znaczenia histopatologii – dyscyplina ta jest absolutnie niezbędna do zrozumienia i wykrywania chorób, co ostatecznie pozwala lekarzowi monitorować, poprawiać oraz rozwijać metody leczenia. Nasze organizmy są dla nas nieustającą tajemnicą, a skrupulatne metody badawcze i niestrudzona praca laboratoriów oraz lekarzy pozwala nam wiedzieć i rozumieć więcej. I wykorzystywać tę wiedzę dla dobra pacjenta