IMMUNOHISTOCHEMIA

Techniki immunohistochemiczne stosowane są przeważnie w diagnostyce patomorfologicznej, czyli wykorzystywane są do rozpoznawania, klasyfikacji oraz określania czynników prognostycznych chorób nowotworowych na podstawie obserwacji zmian morfologicznych w tkankach i narządach. Stanowią uzupełnienie rutynowej diagnostyki histopatologicznej.

Należy pamiętać, że badania histopatologiczne pozwalają określić rodzaj nowotworu i stopień jego złośliwości, ale nie pozwalają wykryć markerów nowotworowych. Dlatego tak cenne są techniki immunohistochemiczne, które umożliwiają nie tylko dokonanie oceny ilościowej zabarwionych komórek, oceny intensywności reakcji i jej lokalizację w komórce, ale także oznaczenie markerów.

Markery nowotworowe
Markery nowotworowe to specyficzne substancje znajdujące się w krwi, moczu lub wycinkach tkanek. Mogą być wytwarzane przez komórki nowotworowe, jak również przez komórki zdrowe, które reagują w ten sposób na trwający w organizmie proces patofizjologiczny.

Oznaczanie markerów oraz ich stężenia umożliwia diagnostykę, ocenę ryzyka, a także monitorowanie stanu zdrowia pacjenta. A odkrywanie nowych markerów pozwala, z kolei, opracować nowe, lepsze metody diagnozowania nowotworów i nowe strategie leczenia.

Immunohistochemia to metoda wykrywania markerów nowotworowych w skrawkach mikroskopowych. Polega na zastosowaniu przeciwciała skierowanego przeciwko poszukiwanym składnikom preparatu, czyli substancji antygenowej.

Antygeny i przeciwciała
Antygen to substancja zdolna do specyficznego wiązania ze swoistym przeciwciałem wytworzonym przez układ immunologiczny. Przeciwciała to immunoglobuliny, które w specyficzny sposób łączą się z konkretną determinantą antygenową. W przypadku badań immunohistochemicznych wybór przeciwciał zależy od celu reakcji, w której mają zostać użyte.

Jednak uwidocznienie miejsca wiązania antygenu zlokalizowanego w komórce lub tkance z przeciwciałem możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego wyznakowania użytego przeciwciała. Przeciwciała znakowane są z reguły fluorochromami (fluoresceina, rodamina), enzymami (peroksydaza, fosfataza zasadowa) lub metalami (złoto koloidalne, ferrytyna zawierająca żelazo). W efekcie uzyskuje się odpowiednie wybarwienie komórek na szkiełku.

Techniki immunohistochemiczne
Głównym zadaniem badania immunohistochemicznego jest identyfikacja swoistych antygenów obecnych w komórkach i tkankach w oparciu o reakcję antygen-przeciwciało, której rezultat widoczny jest w preparacie mikroskopowym. Twórcą tej metody diagnostycznej jest Albert Coons, który w 1940 roku zastosował zjawisko immunofluorescencji do wykrycia antygenów w mrożonych preparatach tkankowych. Od tego czasu procedury immunohistochemiczne są nieustannie udoskonalane w celu zapewnienia jak największej czułości i swoistości badania.

Przygotowanie materiału do badań immunohistochemicznych
Właściwe przygotowanie materiału do badań immunohistochemicznych ma podstawowy wpływ na prawidłowy przebieg reakcji. Poszczególne etapy opracowania materiału mogą zmienić determinanty antygenowe – w wyniku np. denaturacji białek lub przyłączenia nowych grup chemicznych do cząsteczki antygenu – i uniemożliwić ich swoiste rozpoznanie przez przeciwciała.

Utrwalanie materiału do badań
Materiały do badań utrwala się w celu natychmiastowego zatrzymania procesów metabolicznych i autolitycznych, a także wtórnych zmian rozkładowych i gnilnych w komórkach oraz tkankach. Jednak stosowane powszechnie utrwalacze – na przykład aldehydy – mają niekorzystny wpływ na antygenowość materiału. Dlatego w przypadku badań immunohistochemicznych najczęściej stosuje się krótkotrwałe utrwalanie przy pomocy szybko penetrujących utrwalaczy precypitacyjnych, jak np. alkohole.

Zatapianie materiału do badań
Podstawową techniką ograniczania deformacji cząsteczek antygenów znajdujących się w tkance podczas zatapiania jest zamrożenie preparatu. Obecnie jednak dostępne są procedury umożliwiające wykrywanie wielu antygenów w skrawkach parafinowych, ponieważ dostępne są przeciwciała przeciw antygenom, które nie ulegają zmianie w trakcie zatapiania w parafinie.

Odsłanianie miejsc antygenowych
W wyniku utrwalenia i zatopienia materiału bardzo często dochodzi do zmian w determinantach antygenowych. Zmiany te mogą utrudnić, ale nawet uniemożliwić rozpoznanie epitopów przez przeciwciała swoiste. W wyniku obserwuje się słabą intensywność reakcji immunohistochemicznej, a nawet całkowity jej brak. W takich sytuacjach stosowane są metody odsłaniania lub odmaskowywania determinant antygenowych, które przywracają antygenom ich cechy pierwotne.