Poza zmianami genetycznymi na rozwój większości schorzeń, w tym chorób nowotworowych, mają wpływ także czynniki epigenetyczne. Najczęściej występuje metylacja zasad azotowych wchodzących w skład DNA. W genomie występują krótkie (1000-1500 pz) odcinki DNA bogate w dinukleotydy CpG zwane wyspami CpG (Cytosine–phosphate–Guanine). Są to miejsca na nici DNA, w których sąsiadują ze sobą cząsteczki cytozyny i guaniny połączone wiązaniem fosfodiestrowym. W miejscach tych ze szczególnie wysoką częstotliwością następuje metylacja cytozyny do 5-metylocytozyny. Co ważne podkreślenia miejsca CpG bardzo licznie występują w obrębie sekwencji promotorowych, w związku z czym ich metylacje mogą skutkować zmianami w ekspresji określonych genów. W genomie kręgowców około 70-80% dinukleotydów CpG ma grupę metylową przyłączoną do cytozyny. W związku z powyższymi faktami bardzo ważne jest poznanie tzw. „wzoru metylacji” DNA, który odpowiada m.in. za „zabezpieczenie” DNA przed zmianami.
W trakcie reakcji EpiTYPER badana próbka DNA traktowana jest wodorosiarczynem, który powoduje konwersję niemetylowanych cząsteczek cytozyny do uracylu. Następnie DNA podlega standardowej amplifikacji, w wyniku której w miejscach niemetylowanych uracyl zostaje zamieniony na tyminę. Kolejnym krokiem jest trawienie próbki za pomocą enzymów restrykcyjnych oraz denaturacja w celu uzyskania pojedynczych nici. W skład roztworu reakcyjnego wchodzą specjalne dideoksynuklotydy, które po przyłączeniu blokują dalsze wydłużanie. Analiza wzajemnego stosunku ich mas pozwala określić, czy w danym loci nastąpiła metylacja, a także czy dotyczy ona jednego, czy też obu alleli. Przykładowo hipermetylacja ma statystycznie istotny wpływ na przebieg szlaków komórkowych w wielu rodzajach nowotworów a kompleksowa ocena stopnia metylacji w kluczowych onkogenach jest bardzo informatywna dla doboru leczenia.
Możliwe jest analizowanie amplikonów o maksymalnej długości 600 par zasad z czułością do 5% zmian w poziomie metylacji.
Do pobrania:
