---

 

„Nadchodzi genetyka spersonalizowana… czyli jak przy pomocy spektrometrii mas dedykowanej analizie kwasów nukleinowych, sprawnie przejść od teorii do praktyki”

W dzisiejszych czasach obserwujemy pojawianie się coraz to nowszych technik badawczych w dyscyplinach związanych z biologią molekularną. Są one oparte na analizie kwasów nukleinowych (DNA, RNA, cpDNA), i umożliwiają coraz czulsze i szybsze poznawanie podłoża molekularnego procesów fizjologicznych oraz chorób człowieka, zwierząt i roślin. Badania w zakresie szeroko pojętej genetyki spersonalizowanej, inicjują szereg działań zmierzających do opracowania metod jeszcze skuteczniejszej diagnostyki, profilaktyki i terapii chorób cywilizacyjnych m.in. poprzez poznawanie coraz to nowszych biomarkerów oraz sprawniejszą i precyzyjniejszą identyfikację patogenów. Wzrastające znaczenie badań genetycznych w nauce, diagnostyce, agrotechnice i terapii pacjenta, nieustannie generuje zapotrzebowanie, na perfekcyjny sprzęt laboratoryjny oraz rzetelną wiedzę wynikającą z bogatych doświadczeń osób, które przez wiele lat zajmowały się danym tematem.

Istnienie mutacji i polimorfizmów o znaczeniu prognostycznym i predykcyjnym sprawiło, że analiza genomu staje się niezbędnym narzędziem we współczesnej diagnostyce. Niestety, stosowane obecnie na szeroką skalę klasyczne techniki analityczne, wykazują wiele ograniczeń i niedoskonałości — są czasochłonne i mało wydajne, a przy tym nie pozwalają na uzyskanie pełnej informacji o badanym przypadku. Postępujący rozwój technologii, przyczynił się do opracowania wielu nowych, wysoce zaawansowanych rozwiązań, takich jak techniki oparte na zastosowaniu mikromacierzy, ilościowych analiz ekspresji genów, nowoczesnych technik sekwencjonowania czy też wykorzystanie spektrometrii mas do analizy kwasów nukleinowych. Rozwiązania te umożliwiają dokładniejszą i bardziej wydajną analizę materiału genetycznego.

W praktyce bardzo rzadko zdarza się, że nawet bardzo dobrze wyposażone laboratoria mają nieograniczony dostęp do wszystkich najnowszych technologii dostępnych na rynku. Wychodząc takiemu zapotrzebowaniu naprzeciw, firma KAWA.SKA Sp. z o.o. oraz Biobank przy Uniwersytecie Łódzkim, stworzyli przestrzeń konsultacyjno – badawczą, w której każdy badacz, może wdrożyć własny pomysł, wykorzystując zgromadzoną infrastrukturę badawczą. Doświadczony w badaniach molekularnych zespół specjalistów, czeka na pomysły oraz gotowe granty, w których znajdzie się miejsce na wykorzystanie platformy MassARRAY, wykorzystującej spektrometrię mas do analiz genetycznych.

Technika MALDI TOF jest doskonale znaną metodą analiz proteomicznych. Nie każdy jednak wie, że zastosowanie tej technologii do analizy kwasów nukleinowych ze zgromadzonego materiału tkankowego lub krwi obwodowej umożliwia niezwykła czułość platformy MassARRAY, zdolnego rozdzielać wszystkie podstawowe cztery składowe DNA. Są to zasady azotowe: adenina; tymina; guanina i cytozyna. Przy założeniu, że nie ulegną żadnej mutacji wszystkie one posiadają stałą i niezmienną masę wyrażoną w Daltonach. Każda potencjalna zmiana np. substytucja wpływa na masę analizowanego fragmentu DNA. Pozwala to na uzyskanie największej możliwej czułości detekcji wykrywanych zmian w genomie (dużo poniżej 1% występowania w badanej populacji) oraz powtarzalność pomiarów równą precyzji „molekularnej wagi” jaką jest system MassARRAY® Analyzer (AGENA Bioscience, USA). Ten spektrometr mas działa, jak mawia jeden z jego twórców dr Charles Cantor, niczym „elektroforeza w próżni”. Jest to wysokowydajna technologia, która opiera się na wykorzystaniu unikalnego spektrometru mas. System w naszym laboratorium jest dostępny w wersji 96 dołkowej jest wysokiej jakości platformą do wysokoprzepustowych analiz DNA i RNA, pozwalający na skuteczne i precyzyjne pomiary nawet niewielkiej ilości, materiału genetycznego i jego zmienności. Przy użyciu tej techniki, możliwe jest również analizowanie słabej jakości materiału genetycznego, co sprawia, że możliwe staje się rozwiązanie problemu, któremu musimy często sprostać kiedy wdrażamy procedury konieczne do wykonania zaawansowanych analiz genomicznych.

Podstawą w opisanej metodyce badań jest desorpcja laserowa matrycy z którą związane jest badane DNA techniką MALDI (Matrix – Assisted Laser Desorption / Ionization). Jonizacja laserowa zachodzi z tak dobraną energią wiązki, aby nie doprowadzać do fragmentacji cząsteczek lecz tylko do ich wybijania. Dodatkowo wszystkie „składowe cząstki DNA” posiadają po jonizacji ten sam ładunek i różnią się pomiędzy sobą jedynie masą. Następnie działa analizator czasu przelotu – TOF (Time of Flight Analyser) – cząsteczki wprowadzane do analizatora są przyspieszane przy pomocy impulsu elektrycznego i zaczynają dryfować przez komorę analizatora. Na końcu analizatora znajduje się detektor jonów połączony z urządzeniem rejestrującym czas od impulsu przyspieszającego do momentu uderzenia określonej cząsteczki w detektor. Pomiar stosunku masa-ładunek jest oparty na fakcie, że dla impulsu o danym natężeniu czas przelotu jonów wydłuża się ze wzrostem ich masy cząsteczkowej.

[…]

dr Piotr Grochowski

KAWA.SKA Sp. z o.o.