Spektroskopia fluorescencyjna z rozdzielczością czasową (Fluorymetria czasowo-rozdzielcza) jest potężnym narzędziem analitycznym nie tylko w fizyce, chemii fizycznej i wielu zastosowaniach inżynierii materiałowej, ale też w badaniach biologicznych, medycynie i diagnostyce.

Wykonanie pomiaru w technice fluorymetrii czasowo-rozdzielczej wymaga zarejestrowania profilu zaniku natężenia emitowanego światła po wzbudzeniu krótkim błyskiem, zwykle impulsem laserowym, lub błyskową lampą ksenonową. Należy podkreślić, że zanik fluorescencji jest procesem szybkim. Typowa fluorescencja pochodząca z powszechnie stosowanych organicznych fluoroforów trwa od kilkuset pikosekund do kilkudziesięciu nanosekund.

W celu zbadania nie tylko czasów życia fluorescencji, ale także profili zaniku fluorescencji, należy zarejestrować sygnał przynajmniej dla kilkudziesięciu zaników. Im większa ilość danych tym dokładniej można zmierzyć zanik sygnału fluorescencyjnego oraz dokonać rozdziału zarejestrowanego sygnału, zwłaszcza dla zaników wielowykładniczych. Pozwala to na określenie czy emitowany sygnał fluorescencji pochodzi od jednego czy też od kilku emiterów i zmierzenie czasów zaniku fluorescencji dla każdego z nich.

Z pomocą przychodzi technika zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych czasowo (TCSPC – Time Correlated Single Photon Counting). Dzięki okresowemu wzbudzeniu za pomocą laserów pikosekundowych lub subnanosekundowych diod LED, możliwe jest zbieranie danych z wielu cykli wzbudzenia i emisji. W przypadku zaniku trwającego 500 ps sygnał jest próbkowany w krokach czasowych, na przykład o długości 10 ps.

Technika TCSPC pozwala wyznaczyć profil zaniku fluorescencji mając do dyspozycji małą ilość fotonów zarejestrowanych podczas jednego cyklu. Dzięki niej można rejestrować czas zaniku fluorescencji pochodzącej od pojedynczej cząsteczki, co jest wykorzystywane np. w mikroskopii konfokalnej (SMD – Single Molecule Detection).

Fluorymetria: Aparatura niezbędna do przeprowadzenia eksperymentu:

Do zbudowania systemu zdolnego do pomiarów czasowo-rozdzielczej fluorescencji niezbędna jest następująca aparatura:

  • Impulsowe źródło sygnału wzbudzającego wraz ze sterownikiem
  • Detektor rejestrujący pojedyncze fotony
  • Moduł TCSPC do zliczania fotonów
  • Oprogramowanie analityczne
  • oraz niezbędna optyka wraz z układem filtrów lub z monochromatorem emisyjnym

Do pomiarów czasowo-rozdzielczych można również wykorzystać gotowe systemy:

  • Fluorymetry do pomiarów czasowo-rozdzielczych

Typy pomiarów możliwych do wykonania za pomocą aparatury wykorzystywanej do fluorymetrii czasowo-rozdzielczej

W zależności od konfiguracji zbudowanego układu pomiarowego lub od konfiguracji fluorymetru możliwe jest wykonanie następujących pomiarów:

  • Czasowo-rozdzielcze pomiary zaniku fluorescencji
  • Czasowo-rozdzielcze pomiary zaniku fosforescencji
  • Czasowo-rozdzielcza widma anizotropii
  • Czasowo-rozdzielcze widma emisji (TRES)
  • Kinetyka czasów życia luminescencji
  • Widma wzbudzenia i anizotropii w trybie stacjonarnym
  • Widma emisji i anizotropii w trybie stacjonarnym
  • Mapowanie widm emisji i wzbudzenia w trybie stacjonarnym
  • Bezwzględne pomiary wydajności kwantowej luminescencji
  • Pomiar intensywności fluorescencji
  • Pomiary fluorescencji i fosforescencji dla różnych temperatur

Pikosekundowe sterowniki impulsowe – fluorymetria

Pikosekundowe sterowniki impulsowe – Taiko PDL M1, PDL 800-D i PDL 828 – to uniwersalne urządzenia służące do kontrolowania głowic laserowych z serii LDH-I, LDH oraz diod LED z serii PLS.

Impulsowe źródło sygnału wzbudzającego – fluorymetria

Pikosekundowe serii LDH-I wraz ze sterownikiem Taiko PDL M1, serii LDH, serii LDH-FA oraz subnanosekundowe diody LED serii PLS wraz ze sterownikami PDL 800-D oraz Sepia PDL 828.

Detektory

Detektory serii PMA, PMA-Hybrid oraz serii PDM o rozdzielczości czasowej w zakresie pikosekundowym do detekcji pojedynczych fotonów.

Moduły TCSPC zliczające fotony

Moduły TCSPC do zliczania fotonów – TimeHarp 260, PicoHarp 300, HydraHarp 400, MultiHarp 150 i MultiHarp 160 – to jedno lub wielokanałowe liczniki zdarzeń z modułami do zliczania pojedynczych fotonów.

Spektrometry do pomiarów czasowo-rozdzielczych dla fluorymetrii

Spektrometry – FluoTime 300 i FluoTime 250 – do pomiarów czasowo-rozdzielczych to w pełni zautomatyzowane, wszechstronne i bardzo czułe urządzenia zawierające kompletną optykę i elektronikę do rejestrowania fluorescencji, wraz z oprogramowaniem z kreatorami prowadzącymi użytkownika krok po kroku, wspierający go podczas rutynowych, jak i złożonych projektów badawczych.

FluoTime 300 charakteryzuje się niezwykle dużą czułością i stosunkiem sygnału do szumu 29000:1.

FluoTime 250 to kompaktowa wersja spektrometru FluoTime 300.

Oprogramowanie analityczne dla fluorymetrii

Oprogramowanie do sterowania pracą fluorymetrów i analizy danych EasyTau 2 umożliwia pełną kontrolę pracy spektrometrów FluoTime 250 i FluoTime300, oraz pełną analizę uzyskanych wyników w jednym, prostym w obsłudze pakiecie.